Isolierung und Charakterisierung der secY-Gene aus Bacillus licheniformis und Staphylococcus carnosus

Tschauder, S.

Book/Report

FZJ-2018-04281

Isolierung und Charakterisierung der secY-Gene aus Bacillus licheniformis und Staphylococcus carnosus

Tschauder, S. (Corresponding author)FZJ*

1993
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek Verlag Jülich

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek Verlag, Berichte des Forschungszentrums Jülich 2779, 83 p. (1993)

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/19383

Report No.: Juel-2779

Abstract: Gram-positive Bakterien sekretieren häufig große Proteinmengen in das Medium. Aus diesem Grund finden sie in der Industrie vielfach Anwendung in der Produktion extrazellulärer Enzyme. Ober den Sekretionsmechanismus der Proteine ist bei diesen Organismen, im Gegensatz zu $\textit{Escherichia toll}$, wenig bekannt. 1. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene des SecY-Proteins, einem der Hauptbestandteile des Translokationsapparats, von $\textit{Bacillus licheniformis}$ und $\textit{Staphylococcus carnosus}$ isoliert und in $\textit{Escherichla coli secY}$-Mutanten charakterisiert. Die $\textit{B.licheniformis}$ und $\textit{S.carnosus secY}$-Gene liegen in Analogie zum $\textit{E.coli}$ und $\textit{Bacillus subtilis secY}$, im $\textit{spc}$-Operon, das für ribosomale Proteine kodiert. Das 431 Aminosäure umfassende $\textit{B.licheniformis}$ und das 430 Aminosäuren lange $\textit{S.carnosus}$ SecY-Protein enthalten zehn hydrophobe Bereiche, dieTransmembransegrnenten entsprechen. Ein Vergleich aller bisher bekannten SecY-Sequenzen ergab, daß 11 Aminosäuren (2%) strikt konserviert sind und 69 Positionen (12,5%) konservierte Austausche darstellen. Bereiche, in denen gehäuft konservierte Aminosäuren auftreten, sind die Transmembransegmente (TMS) 2, 5, 9 und 10 sowie die hydrophilen Bereiche, die TMS 4 und 5 sowie TMS 8 und 9 miteinander verbinden. Es besteht die Möglichkeit, daß die stark konservierten Regionen an der Translokationsaktivität von SecY beteiligt sind oder für die korrekte Wechselwirkung von SecY mit anderen Komponenten des Sekretionsapparats benötigtwerden. 2. Die Aminosäureaustausche F192 und Y332, die in den TMS 5 und 8 des $\textit{E.coli}$-SecYs vorgenommen wurden, hatten jedoch keinerlei Aktivitätsverlust von SecY zur Folge. Auch die Aminosäure E176, die im Bereich zwischen TMS 4 und 5 ausgetauscht wurde, scheint keine essentielle Rolle bei der Funktion von SecY während der Proteintranslokation zu spielen. 3. Die Expression des $\textit{B.licheniformis}$ SecY-Proteins könnte mit Hilfe einer Fusion zwischen SecY und der alkalischen Phosphatase sowie zwischen SecY und der $\beta$-Galaktosidase nachgewiesen werden. Der Nachweis der Bildung des $\textit{B.licheniformis}$ SecY-Proteins in $\textit{E. coli}$ war die Voraussetzung für die Funktionsuntersuchung des SecY-Proteins durch Komplementationsexperimente. 4. Eine Komplementation des Wachstumsverhaltens und der Translokationsaktivität der temperatursensitiven $\textit{E.coli}$ secY24-Mutanten IQ85 und JM105/3-1 mit den Gram-positiven $\textit{SecY}$-Genen von $\textit{B.licheniformis}$ und $\textit{S.carnosus}$ konnte nicht beobachtet werden. Die Anwesenheit der Gram-positiven SecY-Proteine wirkte sich sogar negativ auf das Wachstum und die Translokationsaktivität der $\textit{E.coli}$-Mutanten bei der permissiven Temperatur aus. Möglicherweise gibt es eine Interferenz durch die Gram-positiven SecY-Proteine mit demProteinexport von $\textit{E.coli}$, die wahrscheinlich auf einer Inkompatibilität der Gram-positiven SecY-Proteine mit dem Gram-negativen Exportapparat beruht. Diese Interferenz konnte eventuell dadurch überwunden werden, daß eine SecY-Proteinkonzentration in der Zelle einen kritischen Wert nicht überschreitet. 5. Durch Selektion auf Wachstum bei der nicht-permissiven Temperatur konnten DNS-Fragmente als Insertionen in dem $\textit{B.licheniformis}$- und vor dem $\textit{S.carnosus-secY}$-Gen isoliert werden, die das Wachstum der $\textit{E.coli}$-Mutante IQ85 komplementieren. Auf den Fragmenten befinden sich dieInsertionselemente 3 und 10 sowie der Promotorbereich der $\textit{argF}$-Gens. Auch weitere Konstrukte wie der amino- und carboxyterminale Teil des $\textit{B.licheniformis}$-SecYs, verursachen eine Wachstumskomplementation der $\textit{E.coli}$-Mutante. Der Translokationsdefekt dieser Mutante IQ85 wurde jedoch nicht sichtbar komplementiert. Der Wachstums- und der Translokationsdefekt der Mutante JM105/3-1 wurden durch die entsprechenden DNS-Fragmente dagegen nicht komplementiert. Es besteht daher die Möglichkeit, daß der genetische Hintergrund des durch chemische Mutagenese hergestellten temperatursensitiven IQ85-Stamm für die Komplementation verantwortlich ist. Dieser ermöglicht wahrscheinlich eine Assemblierung der $\textit{B.licheniformis}$-Fragmente bzw. des $\textit{S.carnosus}$-Proteins mit dem $\textit{E.coli}$-SecY24$^{ts}$-Proteins zu einem funktionsfähigen Protein.

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